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          細胞活力和毒性分析的原理和方法(代謝法)

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          點擊次數:3845 更新時間:2020年10月07日21:40:39 打印此頁 關閉

              靶向細胞的科研研究和藥物研發避免不了細胞活力的分析和追蹤。但依據實驗的最終目的和關注參數的不同,細胞活力的體現,檢測方法也會不一樣。例如細胞增殖檢測適用于比較不同細胞株增殖能力,而細胞毒性分析則可以用于探究候選藥物是否有細胞毒性等。從分析儀器上來說,現階段主流的檢測平臺,如顯微鏡,流式細胞儀和實時熒光定量pcr儀等都可用于細胞活力的分析,但不同的平臺所關注的指標,靈敏度和通量會有所差異,因此需要依據所回答的生物學問題和指標選擇合適的檢測平臺。在上述平臺中,酶標儀提供了96、384孔板的高通量細胞活力檢測方法,靈敏度上能和經典的[3H]胸腺嘧啶摻入法(Thymidine Incorporation Assay)相媲美,因此成為了主流的科研和工業研發中細胞活力和毒性分析平臺。相應的,細胞活力分析也成為了酶標儀的基礎應用之一

              代謝法細胞活力分析原理和介紹:

          代謝法是最常見的細胞增殖檢測方法,其主要包括四氮唑還原法(Tetrazolium reduction),如MTT和CCK-8法等,和刃天青還原法(Resazurin Reduction),如alamarBlue法等。這些方法的原理都是基于細胞的代謝能力還原孵育的底物,其產物通常具有光吸收或熒光屬性,因此能用酶標儀進行高通量細胞活力分析。

          上述方法中,最常見的是MTT法,其屬于酶標儀光吸收應用,利用細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶對MTT的還原,形成不溶于水的結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中和細胞外。最后使用特定的有機溶劑,如二甲基亞砜(DMSO)等溶解后進行 570 nm處檢測。由于MTT本身具有正電荷,因此容易進入細胞,并具有一定的代謝毒性。同時,確切上說,MTT法是檢測細胞線粒體的代謝活力。MTT法.jpg

               近年來在MTT的基礎上一系列類似結構的底物被應用于細胞增殖活力檢測中,主要包括MTS, XTT, 和WST等,它們同樣屬于酶標儀光吸收應用。與MTT不同,這些底物本身具有負電荷,因此不易進入細胞,同時其還原產物可溶于水,因此無需溶解結晶步驟,提升了實驗的操作性和穩定性。該系列中,最常見的是基于WST-8的Cell Counting Kit-8(CCK-8法)。相較于僅依賴線粒體脫氫酶的MTT法,CCK-8法基于細胞內多數的脫氫酶,因此其檢測活力更為準確,靈敏度更高,同時降低了細胞毒性。由于省去了溶解步驟,CCK-8法支持動力學檢測,提高了實驗的靈活性。同時因其毒性低,細胞在完成CCK-8法檢測后還可以用于后續的其他檢測。

          上述的代謝法均屬于酶標儀光吸收應用,雖然相對經濟,但還是會受到光吸收本身的多種限制,尤其是動態范圍窄,容易受到具有光吸收特性的試劑和藥物干擾等。同時,光吸收法受限于比爾定律中的光徑因素,不適用于384或1536孔板等更高通量檢測等。因此,基于熒光檢測的代謝法也成為了主要的細胞活力檢測方法之一,其中常見的是基于刃天青還原的alamarBlue法。

          原理上alamarBlue法與MTT和CCK-8法類似,利用增殖中的細胞固有的代謝能力進行還原無色,無熒光的刃天青,所得的紅色產物resorufin具有強熒光特性,因此可用支持熒光或光吸收的酶標儀進行檢測,提升了檢測的靈活性和抗干擾能力[下圖]。支持熒光檢測的alamarBlue法可具有3-4個動態數量級,具有更寬的檢測范圍和更高的靈敏度。同時,還原產物可溶于水,低毒,因此和CCK-8一樣支持動力學檢測和多重檢測。然而,alamarBlue法更為穩定,因此非常適合追蹤細胞的增殖變化。

          1111.jpg                                    alamarBlue反應前后的熒光(左,530-560 nm 激發)和光吸收變化(右),圖片來自于Invitrogen 技術材料
                  

               成都碩研科技有限公司代理的美國Bioasssay Systems 細胞活性(熒光)檢測試劑盒就是采用的是氧化還原顯色劑刃天青,刃天青本身并沒有熒光性,但一旦被具有代謝活性的細胞還原,則會轉化生成一種強熒光產物(試鹵靈)。活細胞很容易還原這種無毒試劑,從而使熒光強度升高,因此可用熒光分光光度計或熒光分析儀方便地檢測。非活性細胞沒有代謝能力,因此不能還原該顯色劑。所以檢測中觀察到的熒光強度能夠準確檢測活性細胞的數量。該勻相檢測法只需將一種工作試劑加至細胞培養液中,培養后即可測定熒光強度(激發波長= 530 - 570 nm,發射波長= 590 - 620 nm)。

             Bioasssay Systems生產的CellQuanti-BlueTM劑經優化處理,提高了敏感性、可重復性、穩定性。這種基于細胞的勻相檢測法可在多孔板中完成。該試劑與所有培養基以及所有液體處理系統都兼容,可在96孔板和384孔板中進行高通量篩選。適用范圍包括細胞增殖、細胞毒性和細胞凋亡。

          產品特點

          安全:非放射性檢測(參見3H-胸腺嘧啶核苷摻入法檢測)。   

          敏感且準確可準確定量低至100個細胞。

          高效:采用96孔板和384孔板進行高通量檢測,每天可同時處理成千上萬的樣品。

          勻相且簡單:只需加入一種試劑的“混合-培養-測量”型檢測法。無需沖洗或試劑移取步驟。

          高通量:96孔板和384孔板中觀察到的Z系數通常為0.6-0.9。采用高通量篩選液體處理系統該檢測易于自動化。   

          價格便宜:大包裝價格折算后每個孔的檢測成本只要幾毛錢,比CCK8還便宜

          圖片1.jpg 

          圖1. CellQuanti-BlueTM 熒光強度與細胞數量之間的線性關系。 HEK293細胞經連續稀釋后,在384孔板中用CellQuanti-BlueTM 試劑進行處理。熒光強度與細胞數量呈線性關系(R2 = 0.999)。根據空白對照品,估計檢測限大約為100個細胞。   

          圖片2.jpg 

          圖2. HEK293細胞中皂素的劑量依賴性細胞毒性。每孔(40 mL)中的HEK293 細胞數量為15,000個。用不同濃度的皂素對細胞進行處理。經過一整夜的培養后,加入5mL CellQuanti-BlueTM 試劑(實心圓點)。還加入了AlamarBlue試劑(空心圓點),以供對照。培養3小時后,用Molecular Devices LJL分析儀測量熒光強度。數據表示為均值±標準差(SD)(n = 3)。用CellQuanti-BlueTM和AlamarBlue(信號背景比= 3.3倍)測得的皂素IC50值(信號背景比= 4.8倍)分別是0.0016 wt% 和 0.0017 wt%。       


          適用范圍

          細胞增殖: 細胞因子、生長因子和營養成分對活體細胞的影響。

          細胞毒性和細胞凋亡: 評價有毒化合物、抗癌抗體、 毒素和環境污染物等。 

          藥物鑒定: 高通量篩選抗癌藥物。

           

          試劑盒規格

          目錄 #

          試劑

          CQBL-05K

          5,000

          50 mL

          CQBL-10K

          10,000

          100 mL

          CQBL-HTS

          >50,000

          自定義

           

          對照試劑Cat # CTTX-050):50 mg皂素(需單獨訂購)。 

          儲存條件CellQuanti-BlueTM 試劑對光敏感,應在4°C下保存于試劑盒提供的棕色瓶內。對照試劑在-20°C下保存。保質期12個月。

          檢測步驟:

              CellQuanti-BlueTM測是基于具有代謝活性的細胞能將非熒光試劑轉化成熒光產物的原理。對大多數細胞而言,完成這種還原反應需要15小時。然后用熒光分析儀定量測定產物的熒光強度。雖然培養基大多含有酚紅,但酚紅并不會干擾檢測結果。技術要點中的所有數據都是在含有酚紅的培養基中測得的。 

          試劑制備:

          注:使用前先將試劑放置至室溫。

          96孔板測定步驟: 

          1. 在黑色96孔組織培養板中培養細胞(80 mL)。典型的培養基含DMEM、10%胎牛血清和抗生素(青霉素/鏈霉素、慶大霉素等)、氨基酸和其它營養物。不論是粘附細胞還是懸浮細胞,都可進行檢測。每孔的細胞數量可從100至80,000個之間不等。盡管本方案中使用80 mL,但培養體積可從50至150mL之間不等。除待測樣品外,還應設定對照孔,對照孔的培養基應不含細胞或細胞已經有毒試劑(如0.1%皂素)處理過。 


          2. 加入待測化合物和對照品,培養細胞至所需的時間(通常一整夜)。建議一式兩份或一式三份進行檢測??蓪⒋郎y化合物和對照品(20 mL)加入到磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或培養基中。用5 mLPBS(0.1%皂素)溶液方便地配制對照試劑。 

          3. 將CellQuanti-BlueTM 試劑放置至室溫。向每孔中加入10 mL該試劑(每100 mL 細胞培養液)??筛鶕毎囵B液的體積調整所加試劑的體積。輕敲孔板使細胞與試劑混合,在37°C下培養1至5小時。

           

          4. 用熒光分析儀測量每孔的熒光強度。如果采用的是Molecular Devices LJL分析儀,則應使用若丹明濾光鏡(530nm激發濾片、590nm發射濾片和570nm分色鏡)。

           

          384孔板測定步驟:

          1. 在黑色384孔組織培養板中培養細胞(40 mL)。每孔的細胞數量可從100至20,000之間不等。盡管本方案中使用40 mL,但培養體積可從25至60mL之間不等。除待測樣品外,還應設定對照孔,對照孔中的培養基應不含細胞或細胞已經有毒試劑(如0.1%皂素)處理過。

           

          2. 加入待測化合物和對照品,培養細胞至所需的時間。建議一式兩份或一式三份進行檢測。建議將10 mL體積的待測化合物加入到PBS溶液或培養基中。

           

          3. 將CellQuanti-BlueTM 試劑放置至室溫。向每孔中加入5mL該試劑(每50 mL細胞培養液)。輕敲孔板使細胞與試劑混合,在37°C下培養1至5小時。


          4. 用熒光分析儀測量每孔的熒光強度。如果采用的是Molecular Devices LJL分析儀,則應使用若丹明濾光鏡(530nm激發濾片、590nm發射濾片和570nm分色鏡)。

           

          總則

           

          培養時間:培養時間取決于細胞系。部分細胞系的代謝活性很強,因此其所需的培養時間比代謝活性稍弱的細胞系更短??赏ㄟ^多次讀數輕松確定培養時間,如加入CellQuanti-BlueTM 試劑后每30分鐘讀取一次。一般來講,培養15小時就已足夠。當細胞數量很大時,培養時間過長(如 >18小時)可能導致非線性熒光響應。

           

          細胞數量:一般來講,優化后的 CellQuanti-BlueTM 試劑會隨著培養細胞數量的增加表現出大范圍的線性熒光響應。建議測定信噪比最高的各孔的細胞數量。最佳細胞數量可根據細胞連續稀釋而輕松確定。

           

          對照品:盡管不是必需程序,但可以設定陽性對照品,即有細胞毒性或可促進細胞增殖。皂素是一種有細胞毒性的試劑,可從本公司購買(參見技術要點圖2)。每次檢測都應使用空白對照品,即不含細胞或所含細胞已經0.1%皂素處理過的培養基。根據空白對照品可以確定背景熒光,數據分析時應扣除背景熒光。 

          數據分析

          對于細胞增殖或細胞毒性的檢測,待測化合物的活性可計算為細胞數量的變化百分比,計算方法如下,

           

          活性(%) 或細胞活性 (%) = 100 x (Fcmpd - Fo) / (Fctrl - Fo)

           

          Fcmpd  Fctrl 分別是加入和未加入(基質對照)待測化合物時的平均熒光強度。Fo 是空白對照品的平均熒光強度。

           

          對于劑量反應研究,可繪制檢測數據與化合物濃度的曲線。也可采用Prism 或其他數據分析工具通過非線性回歸分析確定EC50(細胞增殖檢測)和IC50(細胞毒性檢測)。

           

          參考文獻

          細胞增殖檢測

          1. Kreisler M, Christoffers AB, Willershausen B, D'Hoedt B (2003). Low-level 809 nm GaAlAs laser irradiation increases the proliferation rate of human laryngeal carcinoma cells in vitro. Lasers Med Sci. 18(2):100-3.

           

          2. Nordling MM, Glinghammar B, Karlsson PC, de Kok TM, Rafter JJ (2003). Effects on cell proliferation, activator protein-1 and genotoxicity by fecal water from patients with colorectal adenomas. Scand J Gastroenterol. 38(5):549-55.  

           

          3. Kipshidze N, Moussa I, Nikolaychik V, Chekanov V, Khanna A, Colombo A, Leon MB, Moses J (2002). Influence of Class I interferons on performance of vascular cells on stent material in vitro. Cardiovasc Radiat Med. 3(2):82-90.  

           

          4. Gloeckner H, Jonuleit T, Lemke HD (2001). Monitoring of cell viability and cell growth in a hollow-fiber bioreactor by use of the dye Alamar Blue. J Immunol Methods. 252(1-2):131-8.  

           

          細胞毒性檢測

          5. Nociari MM, Shalev A, Benias P, Russo C (1998). A novel one-step, highly sensitive fluorometric assay to evaluate cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 1998;213(2):157-67.  

           

          6. Mikus J, Steverding D (2000). A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye Alamar Blue. Parasitol Int. 48(3):265-9.  

           

          7. Byth HA, Mchunu BI, Dubery IA, Bornman L (2001). Assessment of a simple, non-toxic Alamar blue cell survival assay to monitor tomato cell viability. Phytochem Anal. 12(5):340-6.  

           

          8. Lee JK, Kim DB, Kim JI, Kim PY (2000). In vitro cytotoxicity tests on cultured human skin fibroblasts to predict skin irritation potential of surfactants. Toxicol In Vitro. 14(4):345-9.  

           

          評價抗體的細胞毒性作用

          9. Gazzano-Santoro H, Ralph P, Ryskamp TC, Chen AB, Mukku VR (1997). A non-radioactive complement-dependent cytotoxicity assay for anti-CD20 monoclonal antibody. J Immunol Methods. 202(2):163-71.

           

          體外化學敏感性

          10. Sawabe Y, Yamagishi H, Yamaguchi N, Yamamura Y, Oka T (1996). In vitro chemosensitivity of human pancreatic cancer cell lines. Int J Pancreatol. 20(3):185-90.  

           

          篩選細胞毒性化合物

          11. Mikus J, Steverding D (2000). A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye Alamar Blue. Parasitol Int. 48(3):265-9.  

           

          12. Breinholt V, Larsen JC (1998). Detection of weak estrogenic flavonoids using a recombinant yeast strain and a modified MCF7 cell proliferation assay. Chem Res Toxicol. 11(6):622-9.

           

          技術要點

          CellQuanti-BlueTM測試盒經特殊優化處理,且配比恰當,對于細胞增殖和細胞毒性的檢測,這是一種敏感、方便且穩健的檢測手段。該試劑盒的主要特點如下: 

          安全:非放射性檢測(參見3H-胸腺嘧啶核苷摻入法檢測)。   

          敏感且準確可準確定量低至100個細胞。

          高效采用96孔板和384孔板高通量檢測每天可同時處理成千上萬的樣品。

          勻相且簡單:只需加入一種試劑的“混合-培養-測量”型檢測法。無需沖洗或試劑移取步驟。

          穩健且適合高通量篩選:96孔板和384孔板中觀察到的Z系數通常為0.6-0.9。采用高通量篩選液體處理系統該檢測易于自動化。

            

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