當我們純化蛋白時，最重要的就是要保持蛋白在純化過程中不能失活，或者是盡量降低純化過程對蛋白活性帶來的損失。這就意味著蛋白在整個純化過程中要始終保持可溶性和活性。

因此設計一個防止蛋白降解和聚合的蛋白純化緩沖體系就非常重要了，尤其會凸顯在實驗結果上。在設計緩沖buffer時應考慮以下幾個因素：pH值、緩沖體系、鹽離子、還原劑和穩定劑。其中每一個因素都要根據你的目的蛋白進行優化，并以目的蛋白的活性作為優化的評估標準。

1.pH

很多實驗的pH值設定在 7.4以模仿生物條件。假如你的蛋白在這個pH值下是穩定的，那就非常棒了！如果不是，就需要改變pH值找到目的蛋白在溶液中處于可溶性且不會降解的狀態。

一個經驗法則是：蛋白在它等電點pI附近的pH值溶液中會表現得不易溶解，因為蛋白在其等電點的pH值溶液中表面沒有凈電荷，從而容易聚集。這里推薦用Expasy的ProtParam工具快速簡便地計算蛋白等電點pI值，只要提交蛋白序列即可。

2.緩沖體系

一旦確定了緩沖液的pH值，就需要選擇使用什么樣的緩沖體系。首先是在選擇緩沖體系時要確保選擇的緩沖體系在你設定的pH值上確實具有緩沖能力。選擇的緩沖體系，其解離常數pKa值應該在設定的pH上下一個pH值單位內。

再者是確保你使用的緩沖液濃度足夠高以達到實際緩沖溶液的作用，正常一般選擇的濃度是20~100mM。需要記住的是你所使用的緩沖體系不應該影響蛋白活性！例如，磷酸鹽會抑制激酶的活性，所以反應前應徹底地透析掉。

此外，一些緩沖體系對溫度非常敏感，例如Tris-HCl緩沖液，如果你在25℃時將緩沖體系調至pH值8，pH值將在5℃時增加到8.58而在37℃時降到7.71。所以，如果打算在4℃條件下保存蛋白或在37℃進行實驗，就應該考慮到室溫下調的pH值可能在實驗條件中就不適用了。

3.鹽離子

許多緩沖液中含有NaCl，以幫助保持蛋白的可溶性和模擬生理條件。一般常用150 mM的NaCl。

在不同的蛋白純化步驟中，可能需要改變鹽離子的濃度。例如，如果是通過離子交換層析進行蛋白純化，一開始需要降低鹽離子的濃度（5~25mM）避免高離子強度和蛋白競爭和填料結合，這樣可防止蛋白從離子交換柱中流穿，從而使柱子能夠結合目的蛋白，洗脫除去雜蛋白。

其他類型的色譜分離柱，如凝膠過濾柱和Ni2+ 親和層析柱，可能需要更高的鹽濃度。

如果你的蛋白質含有半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基間的氧化可能會成為一個trouble，并可能導致蛋白聚集。為了防止這一點，往往會在緩沖液中添加一些還原劑，如DTT，TCEP或者巰基乙醇。

總的來說，TCEP是這三個還原劑中最穩定的，但它也是最昂貴的。我通常在純化過程的緩沖液中添加DTT，在最后保存酶液的緩沖液中添加TCEP。一般比較合理的還原劑濃度是5~10mM?；旧夏阋_保還原劑濃度要遠遠高于你的蛋白濃度。因為DTT和巰基乙醇在室溫下就會降解，所以需要將添加了還原劑的緩沖液處于低溫保藏，或者在使用時再添加還原劑。

使用時確保柱材料能夠與這些還原劑相容。雖然柱子很容易進行再生，但你的蛋白掛載量將會受到很大影響。許多柱材料都會列出其所能夠承受還原劑的最大濃度，但是我覺得或多或少都會產生影響，并不在于是否達到最大濃度值。

5.穩定劑

最后，可以通過添加一些穩定劑到蛋白純化緩沖液中，以幫助提高蛋白純化時的溶解度和穩定性。在緩沖液中添加惰性蛋白BSA某種程度可以穩定蛋白，但必須確保這些加入的穩定蛋白不干擾實驗。有時添加甘油、聚乙二醇等添加劑可以增加緩沖液粘度，有助于防止蛋白聚集。另外，使用少量的表面活性劑和一些離子化合物如硫酸鹽、氨基酸、檸檬酸等可以屏蔽蛋白間的離子相互作用，幫助蛋白溶解。
通過調整蛋白純化緩沖液的pH、緩沖體系、鹽離子、還原劑和穩定劑，可以建立一個完善的蛋白純化緩沖體系，可以保持蛋白在純化過程中的活性和穩定性！這一生產調整非常有利于蛋白產品、酶制劑產品以及抗體藥物產品分離純化后處理的生產工藝開發！